流式检测Th17细胞IL-17染色比例低效果差的原因分析

作为T细胞免疫调节最常涉及的Th17,不少系统的疾病都能和它扯上联系。目前看到很多同学的科研设计都在做Th17的流式检测,但是很多人实验失败,走弯路耽误进度。在这里简单分析以下遇到的常见原因,并给予解答。

Th17 cells

Th17 cells


免疫通路

免疫通路


Th17细胞是促炎反应的辅助性T细胞,它和调节性T细胞(Treg)在机体的免疫平衡中发挥重要作用,相对于Treg细胞的流式染色(CD4+CD25+Foxp3),很多朋友还是认为Th17难做。主要归结为以下问题:
实验大概流程

实验大概流程


1.抗体组合方法不合适:
目前主要有两种抗体配色方案,如CD3+CD4+IL-17A+和CD3+CD8a—IL-17A+,后者是为了避免在使用离子霉素+PMA对Th17细胞刺激环节造成表面标记的CD4+的表达减少,分群不明显,所以采用了CD8a-的反设门阴选CD4+,但是经过测试,这种反选方案虽然不影响CD4细胞的数量比例,但是却会引起IL-17因子的减少,流式检测图片没那么漂亮,相比直接用CD4+和IL-17A设门的图片,差很多。尤其值得注意的是,抗体用量不建议最大用来,如果是100微升体系细胞悬液染色,建议使用抗体最大说明用量的一半即可。

2.破膜剂不合适:
IL-17因子在细胞膜内,不仅需要使用刺激剂+阻断剂促进分泌,而且在固定破膜环节,也至关重要。建议使用商品化的破膜剂,如果是使用皂素,那就需要在离心洗涤细胞过程中,全程加入皂素,因为皂素的破膜过程是可逆的,所以还是直接使用Triton X-100,浓度大概0.3%合适。固定同样是选用商品化,如果没有,那就使用多聚甲醛(4%)

3.刺激阻断时间:
理论是刺激剂加入后,2h时再次加入阻断剂,继续在37℃的CO2培养箱培养4h,一共6h.记得去盖。如果IL-17检测少,那就刺激8h.

4.外周血样本的处理:
主要可以使用裂红+PBMC提取两种方法,一般小鼠血量少,可以裂红,大鼠能够取血大于3ml,建议梯度离心法分离淋巴细胞。在这之前,样本取血一定要用肝素钠抗凝管,其次是肝素锂,其他抗凝剂不要用。

不理想的IL-17检测

不理想的IL-17检测


如果破除了上述难题,Th17检测也非难事,据说是小鼠和人的样本容易做,大鼠难做一些。
漂亮的流式染色

漂亮的流式染色


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