流式细胞实验是目前国内外都很流行且受认可的细胞检测技术，很多优秀的高分论文都使用流式完美展示了自己的科研成果，长期以来，效应CD4+ T细胞被认为主要是Th1或Th2细胞，后来发现也包括Th9、Th17和Th22细胞（Cosmi等，2014）。 这些细胞的特征在于它们分泌的细胞因子。 Th1细胞分泌IFN-γ，Th2细胞分泌IL-4、IL-5或IL-13，Th9细胞分泌IL-9，Th17细胞分泌IL-17，Th22细胞分泌IL-22。 应该注意的是，这些只是最能定义细胞类型的细胞因子特征，但并不是每个亚群可以产生的所有细胞因子。检测T细胞意义重大。但是在这项实验技术中，最让各位头疼的莫过于难以找到一份切实可行的protocol，因为文献中的操作方法各不相同，主要集中以下几点：
1.抗体染料的配色选择问题（根据流式仪器的荧光通道参数选择抗体，同时考虑刺激对抗体染色的影响，如CD8阴选CD4）
2.胞内和核内细胞因子的检测方法问题（刺激、阻断试剂的浓度，加入时间点问题）
3.反复洗涤操作造成的细胞数目少问题（PBMC制备，细胞计数）
4.具体合适的破膜剂选择问题！（多种多样，难以抉择）
5.FlowJo软件的使用操作问题
T细胞的流式检测过程
流式细胞仪检测外周血中Th1和Th17细胞有两种主要方法：
（1）仅仅使用细胞表面染色。该方法标记细胞表面标志物如CXCR3、CCR6或CD161以检测Th1和Th17细胞是一种简单、快速的替代方法，不过这几个表面标志物并非特异性的，所以单纯的表面标记方可能会使Th1、Th17亚群比例偏高。
（2）对细胞进行体外刺激，检测表面标志物和细胞内因子染色。 表面标记通常为CD3、CD4、CD8。该法更能反映功能特征更准确。
下面对2法的具体操作protocol加以分享：大鼠rat-Th17/Treg为例，使用TBD公司商品化淋巴细胞分离液分离淋巴细胞：
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一：PBMC制备：
1.腹主动脉、眼球采血≥3mL，建议取用医院的肝素抗凝管摇均。（测试肝素钠效果优于EDTA，和肝素锂差不多，如果使用了非肝素抗凝采血管，在刺激后无法溶血，会检测不到细胞因子，建议使用PBMC后再刺激，也可以避免后续的刺激染色影响问题详细参考-本文）；尽可能多采血，需多余血液样本作为：空白+单染+FMO对照；
2.吸取3mL血液至15mL离心管中，加等体积3mL稀释液（PBS或生理盐水）至6mL，吹打混匀；
3.在新15mL离心管中加入与稀释血液等体积6mL淋巴细胞分离液，缓慢将稀释血液贴壁加入到分离液的上层；
4.室温下离心500g×30min；可见血液明显分层；
5.吸取弃去部分上层液，取分离液和血浆之间的约2mm乳白色絮状云雾层的单核细胞1-2mL于另一15ml离心管；
6.加10mL清洗液（PBS），吹打混匀，洗涤离心，300g×10min，弃上清，取沉淀；
7.再次加5mL清洗液，吹打混匀，洗涤。离心300g×10min,弃上清，取沉淀；
8.加1mL含小牛血清的1640培养基，吹打重悬，转移至1.5mLEP离心管。该方法经测试提取淋巴细胞数量非常充足！
二：染色Treg细胞：CD4、CD25+FoxP3（详细核内因子固定破膜法）
-会员于附件中查看该部分具体优化操作步骤！
三：染色Th17细胞：CD3、CD8a+IL-17（详细胞内因子固定破膜法）
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外周血流式protocol-Th17、Treg-Rat.pdf (132.1 KB, 20 次)
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四：胞内细胞因子所需破膜剂的选择：
流式细胞术中最难的其实是固定破膜，这关系到检测细胞因子的成功与否，所以一定要仔细了解每一种破膜剂的机制。
1.固定剂：
（1）多聚甲醛
机制原理：使赖氨酸残基之间发生交联
常用浓度：0.5～4％
固定时间：固定后，保存于PBS中可稳定1～2周。
（2）乙醇
机制原理：通过沉淀、失活起到固定作用，所以可能会使蛋白聚焦，结合位点丢失。同时可溶解脂质起到破膜作用。
常用浓度：70％乙醇或甲醇
固定时间：4度或－20度保存数月。
2.破膜剂
主要有两大类：
（1）有机溶剂：例如甲醇、丙酮等，这类溶剂主要通过溶解膜脂质、凝结膜蛋白实现固定和破膜。
醛类：在固定的同时可以增加细胞渗透性，但还不足以使抗体进入；但如果用有机溶剂固定，那么后续的破膜就不需要了。
（2）去污剂：这类试剂可在胞膜上形成一个孔实现破膜，如皂素、Tween-20、Triton-x等去污剂。用去污剂最常见的应用有：
洗液：在PBS洗液中加入低浓度的去污剂可以减少一些非特异性染色，这个技巧不知道吧？千万别告诉别人。
破膜：对细胞膜打孔，实现胞内抗原染色。溶解细胞膜：用去污剂可提取细胞膜成分，进行免疫共沉淀分析。
Zahra等人对比过Tween-20、Triton X-100、NP-40、蛋白酶K、链球菌溶血素O、皂素等在检测贴壁细胞18S RNA中对细胞FSC/SSC的影响，发现还是Tween-20最好，皂素次之，而其它影响较明显。
破膜剂对比
破膜时需要注意：
（1）荧光素尽量选择小分子，PE和APC属于大分子可能会使破膜后的染色效果差。
（2）需考虑靶蛋白的大小，如果靶蛋白太小，破膜后可能会使其漏出，导致结果假阴性。
（3）用去污剂自制破膜剂，皂素、Tween-20、Triton-x哪个好？我应该选择哪种方法破膜？每种去污剂的作用原理是什么？
用哪种方法破膜，需根据你要标记的靶抗原和要求，例如如果你需要尽可能保持细胞形态和光散射特点，那么就需要选择对形态影响小的固定和破膜成份，并且要检测的靶分子位于胞浆还是胞核，也非常重要。
皂素：选择性与细胞膜胆固醇作用，将胆固醇从细胞膜上移除，从而形成孔洞。
Triton-X和Tween-20：非选择性，同时与蛋白质、脂质作用形成孔洞，并可能将蛋白质、脂质从细胞膜上移除。
使用具体优劣对比
① 细胞形态影响：利用皂素破膜，外周血细胞的流式散射光图中淋巴细胞、单核细胞和粒细胞分群清晰；而另两种破膜剂，通过与细胞膜上的蛋白质和脂质作用发挥破膜效果，易导致细胞发生皱缩，这3群细胞很难分开；
② 对抗原影响：a.标记表面抗原和破膜两步操作的先后顺序有所影响：以检测表面CD8为例，先标记再破膜对CD8无明显影响，而先破膜再标记，乙醇和Triton-X会使表达CD8细胞比例和每个细胞上抗原表达量急剧下降；b.对不同抗原的影响不同：如检测IFN-γ时，Triton-X破膜会导致其检测率降低，而皂素和乙醇无影响；检测TNF-α时，皂素的敏感性要高于其他两种。
③ 其他：皂素的破膜效果是可逆的，一旦被洗掉容易导致破膜失效，因此在后续实验过程中需用含有皂素的洗涤液洗涤；有机溶剂可实现固定和破膜；Triton-X和Tween-20相似，可破坏所有脂质层，可破核膜。总体来说，皂素是相对理想的细胞破膜剂，但无法破核膜，若需破核膜还是要用Triton-X和Tween-20。
总体说来，皂素相对来说更温和，对保持细胞形态较好，但如果要检测核内抗原，还是需要用Triton-X和Tween-20。
拓展：
很多时候，我们想破膜染胞内抗原，大多是采用多聚甲醛固定、Triton X-100破膜，但是对于某些抗原无论怎么样都做不出来，最常见的就是磷酸化蛋白系列。幸运的是，有作者探索发现，用4度甲醇处理5～10分钟，可以磷酸化蛋白被检测到。但是，甲醇用多少浓度比较好？经测试50％甲醇的效果，p-STAT5与未染色对照相比，几乎没变化，而p-ERK和p-S6不错。
所以，当你准备染胞内磷酸化蛋白时，首先要用甲醇破膜，其次，必须得进行预试验，了解你使用的浓度是否适合。用甲醇破膜的时候，得关注你那些表面标记的MFI降低，单核细胞的CD14出现不同程度的降低，50％甲醇处理者MFI降低相对较好，而80％甲醇破膜则降低显著。
建议：尽量选择商品化的fix/perm试剂盒，破膜剂兼具溶血作用，破膜后细胞分群保持完好。
但是因为商品化固定破膜剂很贵，有大神分享一个破膜剂配方专利，具体使用文档也分享给大家：
专利破膜剂的主要成分和配制方法为：
皂角苷（saponin） 0.1－0.5％
叠氮化钠（NaN3） 0.05－0.5％
多聚甲醛（paraformaldehyde） 1－4％
perm配方使用文档.pdf (326.8 KB, 11 次)
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胞内染色的注意点：
（1）抗原表位和荧光素均可能对固定剂敏感，所以需要注意测试。
（2）先染表面标记，然后再固定、破膜染胞内。
（3）有可能，尽量用商品化固定破膜剂。
（4）如果用自配的，可能全程都要用到去污剂成份，包括洗涤时。
（5）使用预冷的固定剂，因为固定过程是一个放热反应。
（6）固定会改变细胞大小。
（7）边加固定剂，边振荡，可以避免细胞成团。
（8）在胞内染色组合中，避免用生物素和FITC，因前者而言，内源性生物素可能影响染色，后者，FITC可能发生非特异性结合。
FlowJo分析和设门：
A图选淋巴细胞，B图和C图排除粘连体，D图排除死细胞，E图选CD3＋淋巴细胞，F图通过CD4/CD8散点图，更准确地圈出CD4＋T细胞，G图分析CD4＋T细胞中的IFN-γ和IL-17A表达，分别为28.9％和1.04％。
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